Methode voor chromosomaal DNA-isolatie en factoren die opbrengst beïnvloeden

DNA-isolatie (ook: DNA-extractie of nucleïnezuurextractie) is een van de meest fundamentele technieken in de moleculaire biologie.

Het is de basis voor vrijwel alle downstream-toepassingen: PCR, sequencing, klonering, genotypering, forensisch onderzoek en diagnostiek.

Een specifieke variant van nucleïnezuuisolatie na immunoprecipitatie is de DNA-terugwinning in chromatine-immunoprecipitatie (ChIP): na reversering van de cross-links wordt het eiwit-gebonden DNA opgezuiverd voor qPCR- of sequencinganalyse.

DNA-isolatie is het proces waarbij DNA wordt vrijgemaakt uit biologisch materiaal - cellen, weefsel, bloed, speeksel, bacteriën of planten - en gezuiverd van eiwitten, lipiden, RNA en andere cellulaire componenten.

Genomisch DNA (gDNA): het volledige DNA-genoom van een organisme, inclusief alle chromosomen.

Celvrij DNA (cfDNA): DNA-fragmenten die vrij circuleren in bloed of plasma, relevant voor non-invasieve prenatale diagnostiek (NIPT) en liquid biopsy bij kanker.

Metagenomisch DNA: totaal DNA geïsoleerd uit een complexe omgeving (bodem, darminhoud), zonder voorafgaande kweek van individuele organismen.

De CTAB-methode (cetyltrimethylammoniumbromide) is de standaard voor de isolatie van genomisch DNA uit plantaardig materiaal.

Planten bevatten grote hoeveelheden polysacchariden en polyfenolen die interfereren met veel andere isolatiemethoden.

Het protocol verloopt als volgt: plantmateriaal wordt fijngemalen in vloeibare stikstof, geresuspendeerd in warm CTAB-extractiebuffer (65 °C, 30 min), geëxtraheerd met chloroform:isoamylalcohol (24:1) om eiwitten te verwijderen, en het DNA wordt neergeslagen met isopropanol.

De fenol-chloroformextractie is een klassieke methode voor de isolatie van hoge-kwaliteit genomisch DNA uit dierlijk weefsel, bloed en celkweek.

Na cellyse met detergent (SDS) en proteinase K-behandeling wordt de waterfase (met DNA) gescheiden van de organische fase (met eiwitten en lipiden) door toevoeging van fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) en centrifugatie.

Voordelen: hoge opbrengst, hoge molecuulgewicht DNA.

Nadelen: fenol is corrosief en toxisch; de methode is arbeidsintensief en minder geschikt voor routine- of hoogdoorvoertoepassingen.

De silica-kolommethode is tegenwoordig de meest gebruikte methode in routine- en klinische laboratoria.

Het principe berust op de selectieve binding van DNA aan silicamembranen onder chaotrope omstandigheden (hoge concentraties guanidinium-isothiocyanaat of guanidinium-HCl): DNA bindt sterk aan silica bij hoge zoutconcentratie en lage pH, terwijl eiwitten en RNA worden doorgespoeld.

Commerciële kits op basis van dit principe zijn onder andere beschikbaar van Qiagen (DNeasy), Thermo Fisher (PureLink) en Promega (Wizard).

Voordelen: snel (30-60 minuten), geen giftige reagentia, reproduceerbaar, geschikt voor automatisering.

Magnetische beads gecoat met silica of andere DNA-bindende groepen worden gebruikt in geautomatiseerde DNA-isolatieplatforms (bijv. KingFisher, Hamilton, Tecan).

Het principe is identiek aan de silica-kolommethode, maar in plaats van centrifugatie worden de beads met gebonden DNA vastgehouden door een magneet terwijl de vloeistof wordt verwijderd.

Alkalische lyse is de standaardmethode voor de isolatie van plasmide-DNA uit bacteriën (miniprep, midiprep, maxiprep).

Chelex-100 is een ion-uitwisselende hars die bij verhitting (95-100 °C) cellen lyseer en tegelijk metaalionen chelateert die DNasen activeren.

De methode is eenvoudig, snel en geschikt voor kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal (haarstengel, bloedvlek, speeksel).

Het geïsoleerde DNA is enkelvoudig gedenatureerd en geschikt voor PCR, maar niet voor enzymatische digestie of klonering.

Effectieve celontsluiting is de meest kritieke stap in DNA-isolatie.

Onvolledige lyse leidt tot lage opbrengst; te agressieve lyse leidt tot fragmentatie van hoog-molecuulgewicht DNA.

Chemische lyse: detergenten (SDS, NP-40, Triton X-100) lossen de celmembraan op.

SDS is sterk en denatureert ook eiwitten.

Mechanische lyse: bead-milling (met zirkoniumoxide of roestvrijstalen ballen in een bead beater), sonificatie of homogenisatie.

Enzymatische lyse: lysozym (voor bacteriën), lyticase (voor gisten), cellulase (voor planten).

De meest gebruikte methode voor kwantificering en kwaliteitsbeoordeling van geïsoleerd DNA is spectrofotometrie met een NanoDrop of vergelijkbaar micro-volume spectrofotometer.

A₃₁₀/A₂₀₀-ratio: ideaal 1,8-2,0.

A₃₁₀/A₂₃₀-ratio: ideaal >2,0.

Fluorimetrie met intercalerende kleurstoffen (bijv. PicoGreen voor dsDNA, RiboGreen voor RNA) is nauwkeuriger dan spectrofotometrie bij lage DNA-concentraties en is niet gevoelig voor RNA-contaminatie.

De Qubit-fluorimeter is de standaard in next-generation sequencing-workflows.

Agarosegel-elektroforese (0,8-1,5% agarose in TAE- of TBE-buffer) maakt de integriteit van het geïsoleerde DNA zichtbaar.

Intact genomisch DNA loopt als een scherpe hoge-molecuulgewichtband boven de markerladder; gedegradeerd DNA geeft een smear over het gehele gel.

Plasmide-DNA toont meerdere conformaties (supercoiled, relaxed, lineair).

Kleuring met SYBR Safe of ethidiumbromide maakt het DNA zichtbaar onder UV-licht.

De meest praktische kwaliteitstest voor DNA dat voor PCR wordt gebruikt: voer een testamplificatie uit met een bekend primerpaar op een huishoudingsgen (bijv. GAPDH, ACTB).

Bloed bevat leukocyten als DNA-bron; erytrocyten bevatten geen kern en dus geen DNA.

Vers bloed in EDTA-buisjes (paarse dop) is de voorkeur; heparine-buisjes (groene dop) bevatten heparine dat PCR remt.

Buffy coat (de laag leukocyten na centrifugatie in een centrifugebuis) geeft de hoogste opbrengst.

Vers of diepgevroren weefsel (−80 °C) geeft de beste resultaten.

Formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed weefsel (FFPE) bevat sterk gefragmenteerd en gecrosslinkt DNA; speciale FFPE-kits met langere proteinase K-behandeling en reversal van crosslinks zijn vereist.

De omzetting van formaldehyde-crosslinks via proteinase K-behandeling is ook een kritieke stap in proximity ligation assays (Hi-C, 3C), waarbij crosslinking juist bewust wordt toegepast om fysieke chromatinecontacten te fixeren.

Gramnegatieve bacteriën (dunne celwand) worden eenvoudig gelyseerd met SDS + proteinase K.

Grampositieve bacteriën (dikke peptidoglycanwand) vereisen voorbehandeling met lysozym (10 mg/ml, 37 °C, 30-60 min) of mechanische lyse (bead-milling).

Voor mycobacteriën (bijv. Plantaardig materiaal wordt altijd gemalen in vloeibare stikstof om DNase-activiteit te voorkomen die bij kamertemperatuur snel optreedt.

Polyfenolen (in fruit, bladeren) en polysacchariden (in wortels, zaden) interfereren met isolatie en downstream-toepassingen; CTAB-methode of speciale plant-DNA-kits zijn vereist.

Forensisch DNA-onderzoek werkt met uiterst kleine en soms sterk gedegradeerde hoeveelheden DNA uit haar, speeksel, sperma, huid of nagels.

Low-copy-number (LCN) DNA-analyse vereist extreem gevoelige PCR-protocollen en strikte contaminatiepreventie.

Alle forensische DNA-isolaties worden uitgevoerd in een dedicated ruimte met positieve luchtdruk en strenge anti-contaminatiemaatregelen.

DNA-isolatie uit haarschachten is een bijzondere uitdaging: de haarschacht zelf bevat nauwelijks kern-DNA omdat de cellen zijn afgestorven, maar de haarwortel (folliculus) bevat nucleaire cellen met genomisch DNA.

Voor een haar zonder folliculus is mitochondriaal DNA (mtDNA) de primaire bron; dit is aanwezig in hogere kopieaantallen per cel en daardoor ook detecteerbaar uit de haarschacht.

Geïsoleerd DNA wordt opgeslagen in TE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) of nucleasevrij water.

Middellange termijn (maanden tot jaren): −20 °C. Lange termijn (jaren tot decennia): −80 °C, bij voorkeur in meerdere aliquots.

Voor biobanking wordt soms droogopslag ( lyofylisatie of dried DNA op FTA-cards) toegepast.

De termen worden door elkaar gebruikt en betekenen in de praktijk hetzelfde: het vrijmaken en zuiveren van DNA uit biologisch materiaal.

Strikt genomen verwijst extractie naar het fysisch-chemisch scheiden van DNA van andere celcomponenten (zoals bij fenol-chloroformextractie), terwijl isolatie het bredere proces beschrijft inclusief lyse, zuivering en concentrering.

EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) is een chelator die tweewaardige metaalionen - met name Mg²⁺ en Ca²⁺ - bindt.

DNasen (enzymen die DNA afbreken) zijn afhankelijk van Mg²⁺ als cofactor.

Door Mg²⁺ te chelaten wordt DNase-activiteit geïnhibeerd, wat DNA-degradatie tijdens isolatie en opslag voorkomt.

Proteinase K is een serine-protease met brede substraatspecificiteit: het degradeert vrijwel alle cellulaire eiwitten, inclusief histonen (die DNA in de kern omwikkelen) en DNasen.

Het is actief bij temperaturen van 37-65 °C en in aanwezigheid van SDS en EDTA.

Natriumdodecylsulfaat (SDS) is een anionisch detergent dat een centrale rol speelt in chemische cellyse.

SDS lost de lipide-dubbele laag van de cel- en kernmembraan op, waardoor de inhoud vrijkomt.

Tegelijkertijd denatureert SDS eiwitten door hun hydrofobe kern te verstoren, wat de binding van eiwitten aan DNA verbreekt en de eiwitverwijdering via proteinase K-behandeling vergemakkelijkt.

De combinatie van SDS en proteinase K bij 55 °C is de meest effectieve chemische lysemethode voor dierlijk weefsel, bloed en celkweek.

Belangrijk aandachtspunt: SDS precipiteert bij lage temperatuur en bij hoge zoutconcentratie.

Ethanol en isopropanol worden gebruikt om DNA neer te slaan uit waterige oplossingen.

Beide alcoholen verlagen de diëlektrische constante van het oplosmiddel, waardoor de hydratatieschil rond de negatief geladen fosfaatgroepen van DNA verdwijnt.

DNA-moleculen trekken dan samen en neerslaan als een wit precipitaat of draden, die na centrifugatie als pellet zichtbaar zijn.

Het verschil tussen beide alcoholen: ethanol (70-100%) vereist koudebehandeling (−20 °C, 30 min) voor volledige precipitatie en wordt ook gebruikt voor de wasstap bij spin-column methoden.

Isopropanol precipiteert DNA al bij kamertemperatuur en in kleinere volumes, maar neemt ook meer zouten mee, waardoor een extra wasronde met 70% ethanol noodzakelijk is.

Een menselijke diploïde cel bevat in de celkern circa 6 pg dubbelstrengs DNA, verdeeld over 46 chromosomen met in totaal ongeveer 6,4 miljard basenparen.

Dat is omgerekend circa 2 meter DNA per cel als de dubbelhelix volledig uitgestrekt zou worden.

Iedere cel bevat daarnaast mitochondriaal DNA (mtDNA) in de mitochondriën: afhankelijk van het celtype zijn dat 100 tot meer dan 1.000 kopieën per cel, elk 16.569 bp groot.

Plantencellen kunnen door polyploïdie aanzienlijk meer DNA bevatten: een octoploïde aardbeicel bevat vier keer zoveel nucleair DNA als een diploïde cel.

Deze termen verwijzen naar de schaal van plasmide-DNA-isolatie uit bacteriën.

Een miniprep verwerkt 1-5 ml bacteriecultuur en levert 5-30 μg plasmide-DNA; voldoende voor klonering-verificatie en sequencing.

Een midiprep verwerkt 25-100 ml en levert 100-350 μg; geschikt voor transfectie.

Een maxiprep verwerkt 250-500 ml en levert 500 μg - 1 mg; vereist voor grootschalige transfectie of virusproductie.

Voeg RNase A toe aan de lysisbuffer (20 μg/ml) of voer een aparte RNase A-behandeling uit na isolatie (37 °C, 30 min).

Commerciële DNA-isolatiekits bevatten doorgaans RNase A in buffer P1 (bij plasmide-kits) of als optionele toevoeging.

Ja, maar FFPE-weefsel bevat sterk gefragmenteerd DNA (typisch <200 bp) door formaline-crosslinking en hitte tijdens paraffine-inbedding.

Speciale FFPE-DNA-kits (bijv. Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue) gebruiken verlengde proteinase K-incubatie (65 °C, 3 uur) en hitte-reversal van crosslinks (90 °C, 60 min).

DNA-isolatie is ook thuis mogelijk met eenvoudige middelen.

De bekendste methode is de bananenextractie: prak een rijpe banaan fijn, voeg afwasmiddel toe (lyseert de celmembraan), een snufje zout (neutraliseert de lading van DNA) en gefilterd sap.

Voeg vervolgens gekoeld 96% ethanol toe langs de wand van het glas - het DNA neerslaat als witte draden op de grens van de twee vloeistoffen en kan worden opgepakt met een cocktailprikker.

Een andere variant gebruikt wangslijmvliescellen: spoel de mond met zout water, spuug in een glas, voeg een druppel afwasmiddel toe en laat gekoelde ethanol eroverheen lopen.

Aardbeien (Fragaria × ananassa) zijn octoploïd: ze bevatten acht sets chromosomen (8n = 56 chromosomen) in plaats van de twee sets die menselijke cellen bevatten.

Bovendien zijn aardbeien zacht en rijk aan cellen die eenvoudig te lyseren zijn.

Ja. Teennagels (en vingernagels) bevatten keratinecellen die tijdens de nagelgroei zijn afgestorven maar nog steeds DNA bevatten.

Dit DNA is gefragmenteerd en aanwezig in kleine hoeveelheden, maar voldoende voor PCR-gebaseerde analyse en STR-profilering voor forensisch onderzoek.

Nagelmateriaal wordt ook gebruikt voor mitochondriaal DNA-analyse bij skeletten of sterk gedegradeerde resten.

DNA-isolatie is een techniek - een laboratoriumproces waarmee DNA uit biologisch materiaal wordt vrijgemaakt en gezuiverd.

Het is geen diagnostische test op zichzelf, maar een voorbereidende stap die noodzakelijk is voor vrijwel alle moleculaire diagnostische testen en onderzoeksmethoden: PCR, sequencing, Southern blot, FISH en genotypering zijn allemaal afhankelijk van voorafgaande DNA-isolatie.

Vier nucleotidebases: adenine (A), thymine (T), guanine (G) en cytosine (C).

Complementaire basenparing: A koppelt altijd aan T (twee waterstofbruggen), G altijd aan C (drie waterstofbruggen).

Dubbelhelix: twee complementaire strengen winden zich om een gemeenschappelijke as.

Antiparallele oriëntatie: de twee strengen lopen in tegengestelde richting (5'→3' en 3'→5').

Voor DNA-isolatie is met name de negatieve lading van de fosfaatgroepen in de ruggengraat van belang: die lading bepaalt hoe DNA bindt aan silicamembranen, hoe het neerslaat met ethanol en hoe zout de precipitatie bevordert.

Zout speelt op meerdere plekken in het DNA-isolatieproces een rol.

DNA is negatief geladen door de fosfaatgroepen in de ruggengraad.

Natriumionen (Na⁺) uit zout neutraliseren deze negatieve lading, waardoor DNA-moleculen dichter bij elkaar kunnen komen en samenklonteren tot zichtbare draden - het precipitatiemechanisme bij de klassieke ethanolprecipitatie.

In de CTAB-methode bepaalt de zoutconcentratie welke moleculen neerslaan: polysacchariden precipiteren bij lage zoutconcentratie samen met CTAB-DNA-complexen, terwijl hoge zoutconcentratie (1,4 M NaCl) selectief DNA in oplossing houdt.

De duur hangt sterk af van de gebruikte methode en het uitgangsmateriaal.

Een snelle silica-kolomextractie uit bloed of een celkweek duurt 30-60 minuten.

Een fenol-chloroformextractie uit weefsel met proteinase K-behandeling duurt 3-12 uur (inclusief overnight incubatie).

In alle cellen van je lijf zit DNA (Desoxyribonucleïnezuur).

Dat is de voornaamste drager van onze genen, ons erfelijk materiaal.

Om DNA te bestuderen in wetenschappelijk onderzoek verzamelen we bijvoorbeeld bloed of speeksel.

Maar het DNA zit goed usgg in je lichaamscellen, je kunt er niet zomaar bij.

We isoleren DNA dan ook in aantal eenvoudige stappen.

Het DNA is onderverdeeld in 46 chromosomen.

Het DNA in 1 cel is wel 2 meter lang.

Een gen doet zelf helemaal niets: het bevat de code om een eiwit te maken.

De overige tekstfragmenten beschrijven aanvullende historische en hedendaagse inzichten over chromatineregulatie en technologische ontwikkelingen.

tags: #chromosomaal #dna #isolatie #opbrengst