Het isoleren van DNA uit cellen vormt de fundamentele eerste stap in talrijke moleculair-biologische onderzoeksprojecten. Dit proces is essentieel voor diverse toepassingen, zoals het produceren van gewenste stoffen door bacteriën voor medische doeleinden, of het modificeren van planten om ze resistent te maken tegen ziektes.
De Rol van Dithiothreitol (DTT) in DNA-isolatie
Dithiothreitol (DTT), ook bekend als Cleland's reagens, speelt een cruciale rol bij de isolatie van DNA. DTT is een krachtig reductiemiddel dat wordt ingezet om disulfidebruggen in eiwitten te reduceren tot dithiols. Dit proces maakt het mogelijk om het DNA vrij te maken uit de beschermende eiwitten waarin het zich bevindt.
Mechanisme van DTT als Reductiemiddel
DTT neemt deel aan een disulfide-uitwisselingsreactie, wat de basis vormt voor zijn belangrijkste toepassingen. In de context van eiwitvermindering wordt DTT doorgaans gebruikt in concentraties van 1-10 mM voor de reductie van eiwit-disulfidebruggen.
DTT is een uitzonderlijk sterk reductiemiddel met een redoxpotentieel van -0.33 V bij pH 7. De reductie van een typische disulfidebinding verloopt via twee opeenvolgende thiol-disulfide-uitwisselingsreacties:
De reductie stopt doorgaans niet bij de gemengde disulfide-soorten, omdat de tweede thiolgroep van DTT een hoge neiging heeft om een ring te sluiten. Hierdoor wordt geoxideerd DTT gevormd en blijft een gereduceerde disulfidebinding achter.
Als reductiemiddel wordt DTT gebruikt om de disulfidebruggen van eiwitten en peptiden te reduceren. Het voorkomt de vorming van intramoleculaire en intermoleculaire disulfidebruggen tussen cysteïneresiduen van eiwitten.
Dithiothreitol reduceert disulfiden naar dithiols, waardoor het DNA kan vrijkomen uit zijn beschermende eiwitten en verdere afbraak van de eiwitten door Proteinase K mogelijk wordt.
Voordelen van DTT ten opzichte van andere reductiemiddelen
Een belangrijk voordeel van DTT als oxidatiemiddel is dat er effectief geen gemengde disulfide-soorten worden gevormd, in tegenstelling tot andere agentia zoals glutathion.
In de meeste toepassingen vervangt DTT het zeer penetrante 2-mercaptoethanol.
Optimale pH-condities voor DTT
Het optimale pH-bereik voor DTT ligt tussen 7.1 en 8.0, maar het reagens kan ook effectief worden gebruikt bij een pH van 6.5-9.0.
Cellulaire Lysering en Eiwitafbraak
Voor de isolatie van DNA worden cellen geliseerd met behulp van een detergent, Proteinase K en dithiothreitol (DTT).
Sarkosyl wordt doorgaans gebruikt wanneer een lyseringsprocedure wordt uitgevoerd onder gekoelde omstandigheden (minder dan kamertemperatuur), omdat natriumdodecylsulfaat (SDS) bij deze temperaturen uit oplossing neerslaat.
Proteinase K: Eigenschappen en Functie
Proteinase K wordt geproduceerd door de schimmel Tritirachium album Limber. Het is een endolytische protease die peptidebindingen klieft aan de carboxylzijde van alifatische, aromatische of hydrofobe aminozuren. Proteinase K wordt geclassificeerd als een serineprotease.
Proteinase K in het extractiebuffer-mengsel inactiveert nucleases en bevordert de lysering van epitheel- en witte bloedcellen om nucleair DNA vrij te maken.
Belang van Nuclease-inactivatie
Nuclease-inactivatie is een zeer belangrijke stap in de DNA-isolatie. Nucleases komen van nature voor in de cel en breken de nucleïnezuren af nadat deze hun functie in de eiwitproductie hebben vervuld. Hierdoor kunnen de individuele bouwstenen van het DNA en RNA door de cel worden gerecycled.
Praktische Stappen bij DNA-isolatie (Voorbeeld)
Hoewel de exacte procedures kunnen variëren, kan een vereenvoudigd voorbeeld van DNA-isolatie de volgende stappen omvatten:
Benodigdheden
- Zout
- Afdwasmiddel/shampoo
- Gedestilleerd water
- Kiwi
- Bekerglas (250 ml)
- Waterbad (60 °C)
- Reageerbuis
- Ijskoude ethanol
- Pasteurpipet
Procedure
- Weeg 3 gram zout af en meng dit met 10 ml afwasmiddel/shampoo en 100 ml (gedestilleerd) water in het bekerglas van 250 ml.
- Ontdoe de kiwi van zijn schil en snijd hem in kleine stukjes.
- Wrijf de kiwi fijn in een vijzel met stamper.
- Verwarm het geheel in een waterbad van 60 °C. Er is ongeveer 10 ml filtraat (= kiwi-extract) nodig voor het vervolg van de proef.
- Houd de reageerbuis schuin en schenk de ijskoude ethanol heel voorzichtig op het extract.
- Wacht tot er op het grensvlak van het extract en ethanol een laag ontstaat met witte vlokken en gasbelletjes. Dit is DNA met daarin ontstane gasbelletjes.
- Na enige tijd zal deze prop omhoog drijven door de opwaartse kracht van de gasbelletjes.
- Haal met behulp van een pasteurpipet wat DNA uit de reageerbuis en maak hiervan een preparaat.
Verklaring van de Stappen
- Zout verandert de structuur van eiwitten.
- In kiwicellen zit een eiwitsplitsend enzym dat de eiwitten in chromosomen splitst.
- Het DNA 'overleeft' het waterbad van 60 °C doordat het een stabiele structuur heeft.