Het Vlaamse waterbedrijf Pidpa heeft samen met TAAG Genetics - Kreglinger een multiplex qPCR-kit ontwikkeld die meerdere indicatoren voor drinkwaterkwaliteit kan detecteren. Na een aanrijkingsstap van slechts 15 uur kan deze methode E. coli, Enterococcus spp. en thermotolerante coliformen aantonen in drinkwaterstalen, wat leidt tot snellere en gerichte acties bij mogelijke verontreiniging. De techniek combineert de kracht van een kweekstap met de specificiteit van multiplex qPCR, waardoor meerdere doelorganismen tegelijk kunnen worden opgespoord en gemeten.
De workflow begint met membraanfiltratie van het drinkwater, waarna de micro-organismen op het filter minimaal 15 uur kunnen aangroeien in een algemeen vloeibaar medium. Vervolgens wordt op deze aangroeide cultuur DNA-extractie uitgevoerd (TAAG X29 Tez-Q Plus) en daarna de multiplex qPCR-methode (TAAG SP28 WaterScan SPID) toegepast op het geëxtraheerde DNA. De doelorganismen zijn E. coli, Enterococcus spp. en thermotolerante coliformen (Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter en Escherichia). Deze groep dient als indicator voor fecale verontreiniging en heeft hoge waarschuwende waarde voor waterkwaliteit.
Omdat drinkwater een nutriëntarm milieu is, is de detectie van zelfs één ongewenste bacteriecel cruciaal. De TAAG-methode richt zich daarom op thermotolerante coliformen: een duidelijk afgebakende groep die significant voorkomt in risicogebieden en die doorgaans hogere temperaturen kunnen verdragen. De totale groep ‘totale coliformen’ vormt geen taxonomische eenheid, wat de ontwikkeling van een PCR-methode bemoeilijkt; daarom ligt de focus op de thermotolerante coliformen in deze multiplex-test.
Het ontwerp van de multiplex-test vereist het gelijktijdig detecteren van meerdere DNA-segmenten die als startpunten voor kopiëren dienen. TAAG Technologies zet hierbij een AI-gedreven multiplex-PCR ontwerpplatform Mila in, dat met next-generation machine learning en simulaties snel het beste ontwerp oplevert. Na een verkennende fase werd de kit ter validatie aan Pidpa beschikbaar gesteld.
Validatie en prestaties
Voor de validatie is een vergelijkende studie uitgevoerd volgens ISO 16140-2 met referentiemethoden op basis van kweek (ISO 9308-1/-2; ISO 7899-2). Inclusiviteit en exclusiviteit werden per doelsoort bepaald samen met de relatieve detectielimiet (RLOD). De resultaten toonden aan dat de methode alle doelstammen kon aantonen en geen non-targetstammen detecteerde. De RLOD was voor alle geteste micro-organismen ≤ 1,0, wat aangeeft dat de methode even gevoelig is als de referentiemethode.
De volledige validatie werd in slechts twee weken in-house uitgevoerd bij Pidpa, wat specialisten opleverde en een intern validatiedossier. De implementatie voorziet in verdere stappen zoals het verzamelen van relevante stammen en stalen voor doorgang naar operationele monitoring. TAAG Genetics bood begeleiding, terwijl Pidpa zich richtte op praktische toepassing en validatie in het distributienet.
Implementatie bij Pidpa en toekomstige toepassingen
Pidpa wil de multiplex qPCR-kit integreren in de monitoringsroutine. Het resultaat is kwalitatief (aanwezig/afwezig) per doelorgaan, waardoor snelle beslissingen mogelijk zijn. De snelheid van de methode is een belangrijk voordeel: resultaten in minder dan 24 uur, terwijl traditionele kweekmethoden 48 uur voor enterococcen en coliformen kunnen vereisen, inclusief identificatie tot op soortniveau.
Een bijkomend voordeel is de automatische berichtgeving via de TxA-server, wat vooral handig is bij stalen die buiten diensturen worden aangeleverd. In de beginfase zal de TAAG SP28 WaterScan SPID schaduwdraaien naast de bestaande kweekmethoden. Bij positieve evaluatie kan de kweekmethode voor enterococcen achterwege blijven, terwijl voor coliformen de traditionele aanpak voorlopig behouden blijft om de ‘totale coliformen’ in beeld te houden.
De lab-omgeving toont enthousiasme voor de kortere hands-on tijd en snelle DNA-extractie die direct in ready-to-load PCR-strips geladen kan worden, wat snelheid en efficiëntie verhoogt. Een prijsconcurrentie met traditionele kweekmethoden is eveneens een pluspunt. Daarnaast wordt gekeken naar RT-qPCR-methoden voor E. coli en enterococcen die zonder aanrijkingsstap gedetecteerd kunnen worden, hoewel automatisering nog ontbreekt in het Pidpa-lab.
Samenvatting van de belangrijkste resultaten
Pidpa en TAAG Genetics hebben samen een multiplex qPCR-kit ontwikkeld die meerdere indicatoren voor drinkwaterkwaliteit tegelijk kan detecteren. De aanrijkingsstap duurt circa 15 uur, waarna E. coli, Enterococcus spp. en thermotolerante coliformen (Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter en Escherichia) aangetoond kunnen worden. De methode is gevalideerd en kan dezelfde orde van grootte betrouwbaarheid leveren als traditionele kweekmethoden, met een aanzienlijk snellere doorlooptijd.
| Doelorganismen | Detectielimiet (RLOD ≤ 1,0) | Beschrijving |
|---|---|---|
| E. coli | ≤ 1,0 | Indicator voor fecale verontreiniging |
| ≤ 1,0 | Indicator voor fecale verontreiniging | |
| Thermotolerante coliformen (Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia) | ≤ 1,0 | Snelle biochemische activiteit indicator |
Technische achtergronden en principes van multiplex-PCR
Multiplex PCR laat toe meerdere DNA-fragmenten in één reactie te amplifieren door meerdere primerparen in één mengsel te gebruiken. Belangrijke voorwaarden zijn onder meer gelijke smelttemperaturen van primers, compatible annealing- en amplificatiecondities, en minimalisatie van primer-dimeren die de efficiëntie kunnen verminderen. De techniek biedt voordelen zoals informatie-uitbreiding bij beperkte monsters, kostenbesparing, tijdsbesparing en hogere throughput, maar kent ook uitdagingen zoals mogelijk primer-inhibitie en amplificatiebias. Een slimme primerontwerpstrategie en geavanceerde platforms zoals Mila kunnen deze uitdagingen mitigeren door simulaties en iteratieve tests.
qPCR (real-time PCR) maakt gebruik van fluorescentie om de hoeveelheid amplificatie tijdens de cycli te volgen, waardoor men via Ct-waarden de hoeveelheid startmateriaal kwantificeert. RT-qPCR combineert reverse transcriptase met qPCR om RNA-gebaseerde doelwitten te detecteren, terwijl multiplexing het mogelijk maakt meerdere doelen in één reactie te detecteren. Het samenspel tussen filtratie, aangroei en qPCR biedt een robuuste methode om drinkwaterkwaliteit sneller te beoordelen dan klassieke kweek, wat cruciaal is voor snelle besluitvorming bij mogelijke verontreinigingen.
Implementatie-overwegingen en toekomstperspectief
Hoewel de methode nog niet alle organismen omvat die wenselijk zijn om opgenomen te worden, vormt haar ontwikkeling een brug naar verdere integratie van moleculaire technieken in drinkwatermonitoring. TAAG en Pidpa zien mogelijkheden voor uitbreiding of aanpassing, afhankelijk van verdere evaluaties en operationele behoeften. Samenwerkingen met andere waterbedrijven en laboratoria kunnen leiden tot bredere validatie en toekomstige maatwerk-kits voor specifieke bedrijfsgerelateerde monitorsingsdoelen.
Samenvattend biedt multiplex qPCR in drinkwatermonitoring snellere en gerichte detectie van belangrijke indicatoren, met mogelijk automatische melding en betere operationele respons. Deze aanpak kan de huidige praktijk verrijken door sneller inzicht te geven in de microbiologische staat van het drinkwaternetwerk en daarmee bij te dragen aan veilig drinkwater voor de bevolking.